☞药敏实验在鱼病防治中的实际应用

水产E线2019-05-13 08:14:27




摘 要: 随着水产养殖精养程度的提高,水环境恶化和滥用抗生素等多方面原因,细菌性渔病频发,且呈现出发病快、来势猛,高死亡率的特点,给渔民造成了巨大的经济损失。笔者设计了一种以LB培养基为基础的快速药敏试验(K-B法)方法,旨在指导渔民准确、及时的对症用药,尽可能减少经济损失;通过反复实践证明,应用该方法一般快则能在4-5h出试验结果,慢则7-9h出试验结果,且试验重复性好,适合于基层推广应用。


关键词:细菌性疾病 药敏试验 K-B法 LB培养基 快速


随着水产养殖业的不断发展,养殖密度过大、环境恶化和其它多种原因导致细菌性疾病日益增多。近几年来,由于养殖户忽略对疾病的正确认识而盲目滥用抗生素,包括用药不当和剂量不准确等情况,增加了细菌的耐药性,使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差,不但造成药物浪费,更为严重的还延误病情。也有一些养殖人员能对疾病做出正确诊断,但在对症下药时却很难凭经验做出判断,在这种情况下,对致病菌做药敏试验是最科学的方法。但是如果按照传统方法进行细菌鉴定和药敏试验,需要很长时间,尤其是细菌鉴定从一开始的细菌分离到最后的动物回归确诊,至少需1周~2周时间,但对农户来说一旦鱼发病了,时间是很宝贵的,早用一天药就减少一天的损失。


测定抗菌药物在体外对微生物有无抵制作用的方法称为药物敏感性实验,简称药敏实验。K-B法,即我们通常所说的纸片扩散药敏试验,是目前临床上最常用的药敏试验方法。其具备技术上简单易行,重复性好;试验成本相对较低,不需任何特殊设备;抗菌药物的选择有很大的灵活性;药敏结果解释性分类(S 、I 、R)易理解等特点[1]。经典的药敏试验选择的是M-H培养基 [1],也有选择肉膏-胰胨培养基[2],而关于LB培养基应用于药敏试验鲜有报告。本文以安徽省滁州市某水库发病的鳊鱼为例,就LB培养基应用于药敏试验(K-B法)做一探讨。


材料与方法:


1.1 材料


1.1.1 LB液体培养基[3]:蛋白胨1%,酵母膏1%,氯化钠0.5%,PH 7.2;121℃20min。 LB固体培养基:是在LB液体培养基的基础上加入1.5-2.0%的琼脂, 121℃20min。


1.1.2 药敏试纸(购自杭州微生物公司)


1.1.3 0.5麦氏标准浊度[1]:将0.5ML0.048mol/l的BaCl2(1.175% w/vBaCl2·2H2O) 加入到99.5ml0.18mol/l的H2SO4(1%W/V)中并不断搅动,以维持混悬状态。


1.1.4 TTC溶液:0.4%TTC水溶液121℃20min灭菌备用。


1.1.5 病鱼:取自安徽省滁州市某水库急性发病的鳊鱼。


1.2 方法


1.2.1 药敏平板的制作


1.2.1.1 LB药敏平板:


将灭过菌的LB固体培养基在无菌操作台中当培养基冷到60℃左右时,倒平板(90mm培养皿,每皿注入培养基约20 ml)晾干备用。


1.2.1.2 TTC显色药敏平板:


将灭过菌的LB固体培养基在无菌操作台中当培养基冷到60℃左右时,加入0.4% TTC水溶液0.6ml/100ml(使TTC浓度为0.0024%)与培养基混合均匀,然后倒平皿(90mm培养皿,每皿注入培养基约20 ml)晾干备用。


1.2.2 麦氏标准管的制作[1]


将0.5麦氏标准浊度液的的正确浓度应光径为1cm,并配有合适比色杯的分光光度计来核实,0.5麦氏标准在625nm处的吸光度值应为0.08-0.1;按每管4-6ml将硫酸钡悬液分装于带旋盖的管子中,管子的大小应与培养或稀释接种菌所用的管子一致,标准浊度管应密封并贮存于室温暗处,使用前宜于旋转混匀器上剧烈震荡,目测其外观浊度应均匀一致。


1.2.3 K-B纸片法的具体步骤为[1]:


用医用棉鉴(灭菌)将麦氏比浊度为0.5的受试菌液(或病变组织匀浆液)0.2ml均匀涂布于含有TTC的LB琼脂平皿表面(均匀涂抹3次,每次涂抹时转动角度60°,注意不要将琼脂划破),待菌液被完全吸收后,将同一批次的含有一定浓度抗菌药物的含药纸片均匀贴于已接种菌液的LB琼脂平板表面(各药片中心距离应大于24mm,纸片距平板内缘应大于15mm.见图示1),36±1℃恒温培养箱中倒置培养4-9h,直至抑菌圈清晰为止,用游标卡尺或直尺量取受试菌的抑菌圈直径,然后与参考标准进行比较来判定受试菌的药敏结果。


直接药敏试验(又称一步法药敏试验)[4]:


用70%的酒精棉球擦拭病鱼体表,用消毒过的解剖剪,分别取肝脏和肾脏等组织匀浆液0.2ml涂药敏平板,按K-B纸片法的具体步骤做药验试验。


1.2.5 富集培养药敏法(增菌培养后再作药敏)


将鳊鱼病变的肾脏与肝脏组织匀浆液接种到装有LB液体培养基的试管或离心管中,36±1℃恒温培养箱中培养4-9h进行增菌培养后做药敏试验。


1.2.6 致病菌纯培养后的药敏情况:


通过稀释法,将纯培养后致病菌液的浓度调整到0.5麦氏比浊管浓度(细菌浓度约为1.5亿/ML);取0.2ml涂药敏平板,按K-B纸片法的具体步骤做药验试验。


2、试验结果:


2.1直接法药敏试验结果:


表1、直接法药敏试验结果


药物名称

抑菌圈直径¢

(mm)

抑菌圈判断¢

(mm)

敏感度

四环素

31

¢ ≥20

极敏

氧氟沙星

35

¢ ≥ 20

极敏

诺氟沙星

37

¢ ≥20

极敏

环丙氟派酸

38

¢ ≥20

极敏


图2、直接法药敏试验结果


2.2富集法培养药敏试验结果


表2、富集法培养药敏结果


药物名称

抑菌圈直径¢(mm)

抑菌圈¢(mm)

敏感度

痢特灵

30

¢ ≥20

极敏

强力霉素

25

¢ ≥20

极敏

新霉素

19

15≤ ¢ ≤20

高敏

复方新诺明

33

¢ ≥20

极敏

四环素

31

¢ ≥20

极敏

红霉素

17

15≤ ¢ ≤20

高敏


图3、富集法培养药敏贴片


图4、富集法培养药敏结果


2.3致病菌纯培养后药敏结果


表3、致病菌纯培养后药敏结果


药物名称

抑菌圈直径¢(mm)

抑菌圈¢(mm)

敏感度

四环素

30

¢ ≥20

极敏

强力霉素

26

¢ ≥20

极敏

痢特灵

29

¢ ≥20

极敏

新霉素

19

15≤ ¢ ≤20

高敏


图5、致病菌纯培养后药敏贴片


图6、致病菌纯培养后药敏结果


2.4 根据抑菌圈试验结果,并具体针对不同的抗生素、菌株参考NCCLS标准或CSLI标准,做出判断。


药物名称

抑菌圈直径¢(mm)

抑菌圈¢(mm)

敏感度

环丙氟派酸

38

¢ ≥20

极敏

诺氟沙星

37

¢ ≥20

极敏

氧氟沙星

35

¢≥20

极敏

复方新诺明

33

¢ ≥20

极敏

四环素

31

¢ ≥20

极敏

痢特灵

30

¢ ≥20

极敏

强力霉素

25

¢ ≥20

极敏

新霉素

19

15≤ ¢ ≤20

高敏

红霉素

17

15≤ ¢ ≤20

高敏


小结:试验证明药敏试纸环丙氟派酸、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明、四环素、痢特灵敏感度最高,但环丙氟派酸、红霉素属于禁止用渔药,可选择其他几种药物使用。实践选用了推荐药物中的诺氟沙星拌料投喂后两天便控制了病情,效果显著!


3、讨论:


3.1 不同TTC浓度对结果的影响:笔者在用显色药敏平板前曾做过预试验使其培养基中TTC的浓度分别为0、0.0008%、0.0016%、0.0024%、0.0032%、0.0040%、0.0048%,发现0.0024%效果最明显,既可使着色菌落染成明显红色,又可保证菌落数与对照(不加TTC)平皿菌落数相接近[5],而0.0032%、0.0040%、0.0048%有抑制作用。


3.2 通过用直接法药敏试验和富集法培养药敏试验、致病菌纯培养后药敏试验,结果发现这三种方法试验结果无差异,以后在实践中可根据需要灵活运用。


4 、思考


细菌耐药速度的快速增长是当今社会的一大难题, 预防因盲目用药引起的耐药菌株的产生, 配合临床尽快准确用药, 降低渔业生产损失,实验室的快速药敏报告显得尤为重要!此项技术简单易行,不需要特殊的仪器设备,重复性好[1]!特建议为鱼病室常规检测,这将针对性指导渔业生产用药,降低生产用药成本与预防由于乱用药而导致的抗药性,将起到重要作用,是目前鱼病防治比较快速、有效的方法,应该积极的推广的生产当中去。


参考文献:


[1] 倪语星,王金良,徐英春,等 抗微生物药物敏感性试验规范[M]上海科学技术出版社;17-26


[2] 朱越雄,曹广力, TTC快速药敏试验在虾细菌病诊断中的应用[J] 水利渔业2003,23(1);59


[3] 周德庆,微生物实验教程(第2版)[M] 2006.3


[4]廖诗英,张世卿,鸡大肠杆菌TTC快速药敏试验方法的研究[J]江苏农业科学2009(5);206


[5] 崔晨光,崔彦刚,邵素云,一步法药敏试验在临床诊断上的应用[J]今日畜牧兽医2010(1);


[6]李先斌,莫丽亚,赵蕊,等。用显色半固体进行快速细菌药敏试验的方法[J]实用预防医学 2006.13.(2);443-444。


[7] 白士茂.氯化化三苯基四氮唑对细菌生长指示的适用性研究[J]浙江实用医学 1997.2(2);12-13


[8]叶超,钱维清. 2,3,5-三苯基氯化四氮唑浓度对细菌菌落计数影响的验证[J]中国药品标准 2007.8(1);66-69


[9]陈淑兰 宋熙瑶 董娟 刘文博 赵金英 控制影响细菌药敏试验(K-B法)质量的各因素 哈尔滨医科大学报 1999年4月第2期; 157-158


[10]曹杨 纸片法测定细菌总数[J]-TTC显色浓度试验 2008年第4期


[11]俞彩娥 童鹤泉 TTC法菌落计数及影响因素的探讨[J] 中级医刊 1990年第25卷第2期;44-45